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青海发光杆菌培养基及培养条件

1.1 材料
菌种：为本实验室筛选，于-20 ℃保存。
发酵培养基：YPD培养基，成分为葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，加水至1 L，pH值7.0，115 ℃灭菌20 min。
1.2 方法
1.2.1 菌种活化
将保存的菌种转接到种子培养基，37 ℃培养24 h,备用。
1.2.2 种子液的制备
从斜面上挑取一环培养物接种到装有20 ml 培养液的50 ml 三角瓶中，于30 ℃、220 r/min条件下震荡培养24 h，备用。
1.2.3 发酵培养
将上述种子培养液按1%的接种量接种于发酵培养基，装液量100 ml，于30 ℃、220 r/min条件下摇瓶培养48 h。
1.2.4 培养基的单因素试验
首先通过PB试验确定影响芽孢得率的显著培养基成分，再通过对显著成分的单因素试验，确定其*添加量。
1.2.5 培养条件的优化
在获得*培养基的基础上，对接种量以及发酵模式（震荡、静置）进行逐一优化。
1.2.6 计数方法
的活菌总数采用稀释平板计数法；芽孢计数则采用把培养后菌液于80 ℃水浴15 min后稀释涂平板计数。
结果与分析
2.1 不同培养原料对液体发酵产芽孢能力的影响
在试验过程中发现青海发光杆菌在若干培养基平板上有产芽孢的能力，其中以加入淀粉的平板产芽孢zui早，在24 h产生，以加入蛋白胨的平板为zui高，因此，综合考虑，我们选择几种工业上发酵罐中常用的碳氮源作为PB实验的筛选因子。
试验模型的R2值为0.91，表明实验有91%的数据能够用此模型拟合，模型情况较好。Shapiro-Wilktest表明数据符合正态分布。同时各因素的作用显著性排序为：蛋白胨>淀粉>大豆粉>葡萄糖>酵母膏>K2HPO4>(NH4)2SO4。其中显著的因素为蛋白胨、大豆粉和淀粉。
2.2形成培养基的确定
根据2.1 节所获得的结果，我们选择了蛋白胨、淀粉和大豆粉等6164个因素为考察对象，其余因素取低水平。对此3因素进行单因素实验，摸索它们的*添加量。
淀粉*的添加量为0.2%、蛋白胨*添加量为0.5%、大豆粉*添加量为1.0%，结合2.1节的结果，确定青海发光杆菌发酵产芽孢的*培养基为淀粉0.2%、蛋白胨0.5%、大豆粉1.0%、葡萄糖0.1%、酵母膏0.07%、MnSO40.02%。
2.3 接种量的单因素实验
在确定发酵培养基的基础上，进一步研究了初始种子接种量对发酵后芽孢数的影响。
随着初始种子接种量的增加，发酵后的芽孢数量也逐步提高，考虑到实际，合理的接种量应该控制在3%~5%。
2.4 不同的培养方式对青海发光杆菌得率的影响
研究表明，提高通气量有助于青海发光杆菌转变为芽孢，而静置培养又可提高初始菌数。因此我们选取了3种不同的作用方式。*的培养方式为连续摇瓶的方式，在此条件下，芽孢数量可以达到3.5×108 cfu/ml。