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亮发光杆菌的冷冻干燥保藏法

（1）收集菌种：作为长期保藏的菌种，应当选择zui适培养基和温度以便得到良好的培养物。培养时间要掌握在生长后期，因为对数生长期的细菌对冷冻干燥的抵抗力较弱，有孢子的微生物需适当的培养以期得到成熟的孢子。大致说，细菌是24~48h，酵母为72h，放线菌和丝状真菌是7~8天以上。从理论上说，是用生理盐水或缓冲液将斜面上刮下的菌体或孢子洗几次，以期洗净培养基中可能带来的各种物质。但在实际操作中如果洗净的条件不适宜会使细胞受损，同时也增加了污染的可能性，一般都省略了这一步骤。操作时先将少量分散剂（保护剂）加入斜面中，轻轻刮下菌苔或孢子，注意不要划破斜面而带入培养基，也可通过纱布脱脂棉的过滤，制成均匀的悬液。悬液的细胞浓度，因细菌和孢子大小不一，不易订出统一的标准，细菌可保持在109~1010/ml左右，孢子应尽可能分散从而制成20支安瓿管。如果用液体培养，则在离心后除去上清液，每10ml所得的菌体可加入1~2ml的分散剂。这个步骤中必需严格的遵守无菌操作和检验培养的程度，因保藏期较长，培养物不纯或操作污染都会造成不良的后果。制成悬液后即在同样严格的无菌条件下用毛细滴管加入灭菌好的安瓿管中，每个安瓿管装量约为0.1~0.2ml，但不必准确控制，通常加入3~4滴即可。

（2）安瓿管的准备:冷冻干燥用的安瓿管形状不一，有的是直形小管，有的在底部带球形，有一些病原菌更需要在安瓿管内再装入很小的玻璃套以保证安全。安瓿管的内径为8~10mm，长度不小于100mm。安瓿管的玻璃要求中性、能耐热、耐压、耐温度的骤变和管底厚度均匀，先用毛细滴管加入洗液浸泡，第二天用水及蒸馏水洗净后干燥，瓶口加脱脂棉塞用纸包好，在121℃灭菌30min后，再在60℃烘箱中干燥。干燥温度不宜过高以防止脱脂棉被烤焦。

（3）冷冻：装入悬液的安瓿管应立即冷冻，不宜放置过久。时间长了会使用菌体自行沉淀成为不均匀的悬液而不利冷冻，同时还会使分散剂起培养基的作用使微生物再次生长或萌发了孢子，这些情况都不利于长期保藏。冷冻的温度达到-30℃以下即可，有冷冻干燥机的可在冷冻架上进行，否则用一个盛有干冰的广口热水瓶将安瓿管在干冰中转动几下即可。冷冻后的安瓿管应立即真空干燥。

（4）分散剂：分散剂或称保护剂，其作用有二：一是使悬浮液悬浮其中保持活的状态；二是减少冷冻干燥时对微生物引起的损伤。分散剂大致可分为低分子化合物如氨基酸、有机酸、糖类等；高分子化合物如蛋白质、多糖等，原则上是二者配合使用的。ATCC及NRRL用马血清、NCTC用1:3的营养肉汤和马血清加入7.5%的葡萄糖。常用的是脱指牛乳和血清。zui简单的是将普通牛乳离心后除去上层乳脂，常压灭菌3次每次1h，温度过高将影响保藏的效果。血清要过滤灭菌，牛乳可加热灭菌且冷冻干燥后易形成均匀粉末故更为常用。

（5）真空干燥：真空干燥可用小箱式的冷冻干燥机，冷冻结束后立即启动真空泵，在15min内使小箱内真空度达到0.5托，1托的真空度约为1mmHg（1mmHg=133.322Pa）以上。随着真空度上升至0.1托以上，可以升高箱板的温度，使小箱内的温度升至25~30℃。此时由于升华还在继续，样品不会融化而能达到干燥的目的。如果有后干燥装置，可以利用油泵进行后干燥，真空箱内的真空度可达到0.01托以上，干燥效果更好。干燥完毕后关闭真空泵、排气、取出安瓿管将管颈拉细，再装在多孔管道上抽真空和融封。这种装置每次可冷冻干燥大量安瓿管，干燥度和真空度都较高，每次需要的时间较长约在10h以上。

（6）离心式冷冻干燥机：另有一种带离心机的冷冻干燥机，其主要区别是在真空箱内装有一个可插入安瓿管口棉塞，插入预冷至-30℃~-50℃的小箱内离心机上。启动离心机及真空泵，约15min后真空度达0.1托时，样品已被冷冻。此时关闭离心机将样品抽干，如有加温装置，则在关闭离心机后逐步加温至25~30℃使样品加速干燥，这种装置可在数小时内完成全部过程。它的主要优点是在离心作用情况下抽真空，不会产生泡沫而影响冷冻干燥的效果，但是安瓿管数受离心插*的限制和污染的机会较多，并不常被采用。冷冻干燥的装置还有钟罩式等，其基本原理与操作均相同，不一一列举。

（7）安瓿管的熔封：熔封必须在第二次抽真空情况下，在多孔管道上进行。一般使用二或三个喷嘴的煤气灯并由空气压缩机送入少量氧气。熔封技术需很熟练，因为既要达到熔封*无任何泄漏，同时又要求外观完整均匀。熔封是在棉塞下部安瓿管已拉细处。

（8）标签：安瓿管的标签应当予以必要的注意，在大量保藏菌种时不允许有任何的差错。可以在灭菌前加入有菌名、日期的小纸片，zui简单的是在加悬液前加入有菌名、日期的小条胶布。应当避免用水溶性的笔来写标签。

（9）安瓿管的保藏及影响保藏因素：安瓿管可放在冰箱内在4~5℃低温下保藏。保藏期为5~10年。室温保藏的效果不佳。影响保藏期的因素很多，菌种、菌龄、冷冻干燥过程中各个环节都与之有关。保藏期和菌种变异关，在冷冻干燥中主要是由于干燥样品中含水量的影响。通常含水量在1~3%时较好，5~6%就会相应降低，虽然不一定进行含水量的测定，可用目测或真空度来控制，但应当引起必要的注意，此法保藏的菌种可以长期保藏菌种的稳定，有报道（2）将保藏10年的547个属的细菌进行生理、生化、血清学的测定而没有发生变异，许多用的放线菌生理、生化、血清学的测定而没有发生变异，许多用的放线菌等微生物菌种亦都采用这种保藏方法达到长期保存的目的。

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