感觉态细胞的特点:
1.限制缺陷型:外切酶和内切酶活性缺失,外源基因进入后可稳定存在。
2.感染缺陷型:防止重组细胞扩散污染。
3.重组整合缺陷型:外源基因进入后游离在染色体外,不会发生重组。
4.高转化率:易接受外源核酸。
5.遗传互补:与载体有选择标记互补的表型,能够筛选。
感觉态细胞的实验步骤:
(1)感受态细胞的制备
1)挑取大肠杆菌划线于LB平板上,在37℃恒温培养过夜(16-18h)。
2)挑取单菌落于50mLLB培养基中37℃、200r/min培养3-4h,至出现薄雾状菌悬液即可。
3)将培养液置于冰上预冷15min,并间断轻轻摇动。
4)将冷却的培养液倒入己在冰上预冷的50mL离心管中。
5)在冷冻离心机中离心,4℃3000r/min离心5min。
6)弃上清、加入15mL冰上预冷的0.1mol/LCaCl2溶液,轻轻旋转,使细胞充分重新悬浮,冰上放置20-30min。
7)于4℃3000r/min离心5min。
8)弃上清,加入2mL冰上预冷的0.1mol/LCaCl2溶液,轻轻旋转,使细胞充分重新悬浮,5min后就可以用于转化实验,或添加保护剂,低温或超低温冷冻贮藏备用。
(2)感觉态细胞的DNA转化
1)将-80℃保存的细胞置于冰中融化10分钟。
2)取细胞移至新的转化管中。向细胞中加入0.1ng~10ng(3µl~10µl)的转化用DNA,轻轻混匀后冰中放置30分钟。
3)42℃水浴中放置45秒钟后,立即于冰中放置1~2分钟。
4)加入890µl37℃预温的SOC培养基,在37℃200r/min振荡培养50-60min,使细菌复苏,抗性得以表达。
5)取100μL左右转化液涂布在含有4μLIPTG,40μLx-ga1和氨苄青霉素(Amp50μg/mL)的平板上。
6)倒置平板于37℃培养16-18h,观察实验结果并记录。