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实验步骤：

1.烤片： 将待做切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中至少烤1 hr；石蜡包埋组织切片3~4μm 厚度

2.脱蜡： 切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3 次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；

3.水化： 切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95%乙醇2 次（每次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自来水冲洗，ddH2O 洗2×2min；

4.抗原修复： 根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复，常采用高压、微波（温度达到98~100℃）或酶消化修复法，室温自然冷却，自来水冲洗，ddH2O 洗2×2min，TBS 洗涤（2×2min）（具体修复方法见附1）* 注：有些抗原勿需修复，

直接进入第5 步封闭。

5.封闭： 滴加试剂B，37℃湿盒孵育30 min；

6.加一抗：滴加用试剂C（即用型一抗），37℃湿盒孵育2 hr 或4℃过夜；

7.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）；

8.封闭： 滴加试剂B，37℃湿盒孵育10 min；

9.加二抗： 滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二抗（试剂D），37℃湿盒中孵育30 min；

10.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）；

11.封闭： 滴加试剂Tween 20，37℃湿盒孵育封闭20 min；

12.加HRP-SA： 滴加用抗体稀释液稀释的试剂E（1：50~200，终浓度5~20 nM），37℃湿盒中孵育30 min；

13.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min），TBS 洗涤（2×5 min）；

14.显色：应用DAB 溶液（试剂F）显色；

15.复染：自来水充分冲洗，复染，脱水，透明；

16.封片： 待组织标本干后，用试剂缓冲甘油封固剂封片；

17.观察成像： 显微镜下观察成像。

磷酸化腺苷单磷酸活化蛋白激酶α1抗体

双调蛋白（结肠直肠细胞源性生长因子）抗体

磷酸化水通道蛋白2抗体

粘附相关激酶抗体

磷酸化粘附相关激酶抗体

磷酸化蛋白激酶B抗体

磷酸化水通道蛋白2抗体

磷酸化APP淀粉样肽前体蛋白抗体

磷酸化蛋白激酶B抗体

磷酸化APP淀粉样肽前体蛋白抗体

磷酸化活化转录因子4抗体

磷酸化雄激素受体抗体

磷酸化雄激素受体抗体

磷酸化蛋白激酶AKT1,2,3抗体

磷酸化蛋白激酶B抗体

磷酸化活化复制因子2抗体

凋亡相关蛋白3抗体

自噬相关蛋白18抗体

自噬相关蛋白4A抗体

载脂蛋白A4抗体

12脂氧合酶抗体

血管紧张素III抗体

腺苷酸环化酶3抗体

血管动蛋白抗体

腺病毒早期E1A蛋白抗体

磷酸化活化复制因子2抗体

磷酸化活化复制因子2抗体

磷酸化失调症蛋白1抗体

锚蛋白重复结构域蛋白17抗体