“杂音"染色种类繁多,产生的原因也多种多样,为了便于说明,笔者将其归纳为下面几种。
1、灶片状着色
切片中着色区东一块西一块,呈灶片状分布,出现这种问题的原因有:(1)裱片时水未排尽,在局部形成气泡使组织突起,染色时试剂渗入后不易洗尽,显色过深所致。解决办法是,漂片盒里的气泡应去尽,晾片热台不能平放,应有45度左右的斜度,利于水流走和蒸发。(2)坏死组织灶,组织坏死后破坏、酶的释放、蛋白游离、分解,复杂的肽链残段(如Fc段)可能与一抗或/和二抗结合导致zui终着色。解决办法是在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片。(3)制作APES胶片时,胶的浓度太高,干燥后在玻片上留下白色小点,显色时白色小点着色。解决办法是按照标准的制备方法进行,即5%盐酸酒精(5 ml盐酸+95%酒精95 ml)浸泡玻片4小时、热水冲洗玻片1小时、蒸馏水洗玻片1分钟、丙酮浸泡玻片5秒钟后空气干燥(室温)、2% APES(2 ml APES+98 ml丙酮)浸泡玻片5分钟、玻片过一下丙酮(1-2秒钟)、玻片过一下蒸馏水(1-2秒钟)、37 度干燥、室温储存备用。如果制片过程中,因丙酮逐渐挥发而胶变浓时可适当加入一些丙酮。
2、浆着色
胞浆着色是所有“杂音"染色中有欺骗性的着色,着色区局限在细胞内,间质无着色,看上去与真实的免疫反应着色几乎一样,很难区别。胞浆里含有较多的蛋白质,因此,很多非特异性的染色除了见于间质也可以出现在胞浆中。这种原因造成的着色,可以通过血清封闭解决。还有因内源酶造成的着色,如血红蛋白(红细胞)、肌红蛋白(肌细胞)、细胞色素(粒细胞、单核细胞)、过氧化氢酶(肝、肾),这些可用过氧化氢进行封闭。巨噬细胞吞噬各种抗原物质或Fc片断而出现胞浆着色,这种着色不易避免,但可以通过形态学辨认出巨噬细胞而引起重视。内源性生物素的着色有欺骗性,因为它广泛的存在于组织细胞中,我们研究结果显示:冰冻组织中存在内源性生物素,经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭,加热抗原修复后造成内源性生物素暴露,内源性生物素暴露的强度在不同的组织有所不同,从弱阳性(+)到强阳性(+++),内源性生物素在组织中的分布形式,既有散在分布也有弥漫分布,主要以颗粒状形式存在于胞浆中,内源性生物素广泛存在于上皮源性组织,特别是腺上皮组织,亦存在部分非上皮组织,内源性生物素不仅存在人体组织也存在大鼠组织,内源性生物素暴露的强弱与修复液有关,其强度增加依次为:柠檬酸、EDTA、EGTA,热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭,非生物素检测系统Polymer两步法(EliVision、EnVision)可避免生物素干扰。
3、核着色
不适当的组织处理可以出现细胞核着色,如组织在二甲苯里浸泡时间太长(如从星期五浸泡到下星期一)、缓冲液中浸泡时间太长、组织变干、微波修复液的PH值和修复时间不当或修复过程中修复液留下得太少,未没过组织等。解决办法是严格按照操作常规进行工作。
4、间质着色
着色部位主要在间质,间质着色的原因很多,如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的连接而着色,加一抗前的血清封闭这一步就是为了避免非特异型的结合。又如血清中的免疫球蛋白常常渗出到组织间质,很容易与抗体结合,造成间质着色,特别是lambda和kappa染色时。当甲状腺胶质外溢到组织间质时,做甲状腺球蛋白染色也会出现间质着色。抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色,我们曾遇到CD20抗体不纯,除了染上B细胞外还染上了间质。
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