SP法双重染色步骤
1～6步骤与SABC法相同，但无需使用生物素阻断剂：
7．切片加入A特异性（如兔抗A抗体），4=C孵育后，PBS冲洗3次，每次5分钟
8.滴加生物素化二抗（如抗兔二抗），室温孵育切片10分钟，继而PBS冲洗3次，每次5分钟；
9.滴加链霉菌抗生物素蛋白—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟
10．碱性磷酸酶显色液（BCIP／NBT）显色（紫蓝色）．PBS冲洗3次，每次5分钟；
11．滴加0．05％盐酸，室温10分钟（可避免已显色的抗原褪色）；
12．滴加抗小鼠二抗同种属的非免疫血清，37~C孵育10分钟；
13．滴加B特异性（如小鼠抗B抗体），4~C孵育。PBS冲洗3次，每次5分钟；
14．滴加生物素化抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟。PBS冲洗3次，每次5分钟：
15．滴加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟
16．过氧化物酶显色液（AEC）显色（鲜红色）．PBS冲洗3次，每次5分钟
17．苏木精复染细胞核；
18．水溶性封片剂封片。
在使用SP法双重染色之前需要对待测抗原的性质、二抗的种属类型和显色系统进行详细设计。购买免疫组化双染试剂盒时；应选择与设计方案相同的配套试剂。在选择一抗时应避免定位在细胞的同一部位（如胞核、胞浆和胞膜）的两种抗原，如果不可避免，选择免疫荧光组织细胞化学双重染色方法，因为两种不同颜色的荧光重叠后呈现另一种颜色的荧光（如红色荧光与绿色荧光重叠呈现黄色荧光），它比SP法的显色系统更容易区别和辨认阳性结果。
在进行双重染色之前，必须对所选择的一抗分别进行单独染色预实验，预实验条件必须与双染条件相同，在观察预实验结果和定位正确后，再进行双染实验。
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