Rat eNOS-3ElisaKit

本试剂仅供研究使用  标本：血清或血浆及相关液体

原理：

采用双抗体夹心法测定MTHFD2水平。用纯化的MTHFD2抗体包被微孔板，制成固相载体，实验时依次在微孔板中加入样本及标准品，并加入 HRP 标记的 ABP 抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，反复洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，再用硫酸终止反应，转变成黄色。颜色的深浅和样品中的 ABP含量呈正相关。采用酶标仪在 450nm 波长测定吸光度（OD 值），根据标准曲线，计算测试样品中 ABP 浓度。

试剂盒组成：

性能:

1. 灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。

2. 特异性：不与其它细胞因子反应。

3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。

结果判断与分析:

1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的待测物质标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的待测物质含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

操作步骤：

1. 取出试剂盒，室温（20-25℃）放置 30 分钟。

2. 分组：取出 96 孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。分别设标准

品组（6 个浓度）、空白孔、待测样品组。

注：为减少实验误差，保证准确性，建议设置复孔。

3. 加样：依照标准品的顺序分别加入 50ul 的标准品溶液于空白微孔中；空白对照孔加入 50ul 的蒸馏水；其余微孔中加入 50ul

的待测样本。

4. 加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入 100ul 的酶标溶液（空白对照孔除外）。

5. 温育：酶标板用封板纸密封后，放入湿盒内于 37℃恒温孵育 1 小时。

6. 洗板：用稀释后的洗涤液注满每孔，静置 15-30s，充分清洗酶标板 5 次，用吸水纸拍干。

7. 显色：各孔加入显色剂 A 液 50ul 后，再加入显色剂 B 液 50ul。

8. 终止：25-37℃下避光反应 10-15 分钟，加入 50ul 终止液。

9. 读板：在 450nm 波长读取各孔的 OD 值。
ELISA试剂盒为什么要严格按照说明书操作？

一.先说最严重的操作错误，看错或压根不看试剂盒配套说明书，不按操作步骤加样。比如把竞争法的试剂盒当作双抗体夹心法来做，导致的结果就是整板显示很强的蓝色，无任何梯度。

二.混用别的试剂盒里的试剂。不同厂家或者相同厂家的不同试剂盒，所含的试剂成分很可能是不一样的，混用导致的结果是，浪费珍贵的样本，样品的回收率达不到预期值，如果混用不同试剂盒的酶复合物，会导致显色过弱或过强，因为每种试剂盒所用酶复合物效价可能不一样。

三.不看文献或者不做预实验。比如某个试剂盒按照其灵敏度范围和文献报道推算样本应该1:10稀释，结果稀释成1:1000，导致的结果是显色过弱，结果不可用。

车.不校准移液器及培养箱的温度湿度。导致工作试剂浓度不准确，孵育温度不合适，实验带来误差。

五.洗涤不充分，每孔洗液加样过少，或者残留。导致的结果是显色过快，同时背景较高。

六.手洗板时所用枪头没有悬空加入洗液，导致洗液污染，整个实验失败。

七.剩余酶标板条未及时放入干燥袋，导致酶标板受潮，下一次再做时，显色过弱或污染，CV值过高。

八.试剂盒保存条件不当。试剂盒要求放4℃的，放在了-20℃。或者要求放-20℃的，放在了4℃。均会导致试剂盒敏感性下降。

以上只是最常见的操作错误。顺利完成一次ELISA实验需要注意的细节很多，许多操作环节都影响到检测的质量。

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