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    酶联免疫法测定大肠杆菌菌体蛋白质残留量

    点击次数:911  更新时间:2017-03-21

    (1)包被液(P H9.6碳酸盐缓冲液) 称取碳酸钠0.32g、碳酸氢钠0 .5 8 6 g ,置200ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度。
    (2 )磷酸盐缓冲液(p H 7 . 4 )称取氯化钠8g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至500ml, 121°C灭菌15分钟。
    (3 )洗涤液(pH7.4) 量取聚山梨酯20 0.5ml,加磷酸盐缓冲液至500ml。
    (4 )稀释液(p H 7 . 4 )称取牛血清白蛋白0.5g,加洗涤液溶解并稀释至100ml。
    (5 )浓稀释液称取牛血清白蛋白l.O g , 加洗涤液溶解并稀释至100ml。
    (6 )底物缓冲液(pH 5 .0枸橼酸-磷酸盐缓冲液) 称取磷酸氢二钠(Na2HP04 . 12H20 )1 . 84g、枸橼酸 0. 51g,加水溶解并稀释至100ml。
    (7 )底物液取邻苯二胺8mg、30%过氧化氢30^1,溶于底物缓冲液20ml中。临用时现配。
    (8 )终止液lm o l/L硫酸溶液。
    标准品溶液的制备  按菌体蛋白质标准品说明书加水复溶,精密量取适量,用稀释液稀释成每lm l中含菌体蛋白质500ng、250ng、125ng、62. 5ng、31. 25ng、15. 625ng, 7. 8125ng的溶液。
    供试品溶液的制备  取供试品适量,用稀释液稀释成每l m l中约含2 5 0 ug 的溶液。如供试品每l m l中含量小于500ug时,用浓稀释液稀释1倍。
    测定法 取兔抗大肠杆菌菌体蛋白质抗体适量,用包被液溶解并稀释成每lm l中含10ug 的溶液,以100ul/ 孔加至9 6孔酶标板内,4 °C放置(16~1 8小时)。用洗涤液洗板3次;用洗涤液制备1%牛血清白蛋白溶液,以200u1/孔加至酶标板内,37°C放置2 小时;将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3 次;以100u1/孔加人标准品溶液和供试品溶液,每个稀释度做双孔,同时加入2 孔空白对照(稀释液),37°C放置2 小时;用稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白质抗体1000倍,以100u1/ 孔加至酶标板内,37°C放置1 小时,用洗涤液洗板1 0次,以l00ul/孔加人底物液,3 7 °C避光放置4 0 分钟,以5 0 p l /孔加入终止液终止反应。用酶标仪在波长4 9 2 n m 处测定吸光度,应用计算机分析软件进行读数和数据分析,也可使用手工作图法计算。
    以标准品溶液吸光度对其相应的浓度作标准曲线,并以供试品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白质含量,
    按以下公式计算:
    供试品菌体蛋白质残留量(%) = (c×n)/(T×106)×100
    式中 c为供试品溶液中菌体蛋白质含量,ng/ml;
         n为供试品稀释倍数;
         T为供试品蛋白质含量,mg/ml。

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