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操作步骤:

1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在di一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在di一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从di一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为180 ng/L，120 ng/L ，60 ng/L，30 ng/，15 ng/L）。

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4. 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7. 温育：操作同3。

8. 洗涤：操作同5。

9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟。

HUVEC-12, 人脐静脉血管内皮细胞系

HUM, 正常人主动脉平滑肌细胞

HAVSMC, 人主动脉平滑肌细胞

LX-2, 人肝星形细胞株

3T3-L1, 小鼠前脂肪细胞

C2C12, 小鼠肌原细胞

 细胞名称

MCF-7（MCF7）（ATCC来源）, 人乳腺癌细胞

MDA-MB-231（ATCC来源）, 人乳腺癌细胞

Raji，人Burkitt's淋巴瘤细胞

Saos-2，人成骨肉瘤细胞

Caco-2，人结直肠腺癌细胞

NCI-N87 [N87]人胃癌细胞

MGC80-3（MGC-803）人胃癌细胞

EC109，人食管癌细胞

HGC-014191人胃癌细胞

AGS人胃腺癌细胞

U0069人胶质瘤细胞

THP-191人单核白血病细胞

HuH-026人肝癌细胞

SK-MEL-1, 人皮肤黑色素瘤细胞

A549, 人肺癌细胞系

SKOV3/Taxol-25, 人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株

A-375 [A375], 人恶性黑素瘤细胞株

A549/DDP, 人肺腺癌耐药细胞株

SP2/0, 小鼠骨髓瘤细胞

WM35, 人黑色素瘤细胞

BxPC-3, 人原位胰腺腺癌细胞株

U-2 OS, 人骨肉瘤细胞

WM451, 人黑色素瘤细胞

SW 1990 [SW-1990, SW1990] , 人胰腺癌细胞