技术文章/ARTICLES

反应流程常规程序:

将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环25～35次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持3-7min，使产物延伸完整，4℃保存。

2．复性（退火）和延伸温度

复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。

3．反应时间

变性步骤一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。

4．循环次数

循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104～105数量级时，循环数通常为25～35次。

平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不ce底。

5．PCR反应液的配制

PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。

对于使用具3’-5’外切活性的高温DNA聚合酶时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，A管含模板、引物和dNTP，以及调整体积的H2O，B管含缓冲液、DNA聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。

无水磷酸三钠/三碱式磷酸钠/原磷酸三钠/磷酸三钠/磷酸钠/Trisodium phosphateAR，98%，500克国产/进口

2,2-联喹啉-4,4-二羧酸钠/4,4-二羧基-2,2-联喹啉二钠/2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠/BCABR，98%5克国产/进口

D(-)酒石酸钠/酒石酸钠/D-酒石酸钠/2,3-二羟基丁二酸钠/D-(+)-Tartaric acid disodium saltAR，99%500克国产/进口

L(-)酒石酸钠/酒石酸钠/L-酒石酸钠/L-(+)-Tartaric acid disodium saltAR，99%500克国产/进口

偏钒酸钠/二水偏钒酸钠/钒酸钠/Sodium metavanadate dihydrateAR，99.9%，25克国产

无水偏钒酸钠/钒酸钠/Sodium metavanadateAR，99%，25克国产/进口

四苯硼钠/四苯基硼酸钠/四苯硼酸钠/NaTBPAR；99%，10克国产/进口

氟化钠/Sodium fluorideGR，99%，500克国产

氢氧化钠/苛性钠/烧碱/钠氧条/苛性曹达/固碱/火碱/Sodium hydroxideGR，97%，500克国产

氟硼酸钠/四氟硼钠/四氟硼酸钠/Sodium fluoroborateCP，98%，500克国产

六偏磷酸钠/偏磷酸六钠/格来汉氏盐/卡甘/磷酸钠玻璃/格腊哈姆盐/六偏/六聚偏磷酸钠/Sodium hexametaphoshpateCP，95%500克国产/进口

萘酚AS-MX磷酸盐/色酚AS-MX磷酸盐/磷酸萘酚AS-MX/Naphthol AS-MX phosphate高纯，99%500毫克国产/进口

萘酚AS-BI磷酸二钠/萘酚磷酸钠/7-溴-N-(2-甲氧基苯基)-3-(磷酸氧基)萘-2-甲酰胺二钠盐/Naphthol AS-BI phosphate disodium saltBR，99.5%100毫克国产/进口

单硬脂酸甘油酯/硬脂酸甘油酯/单甘酯/甘油单硬酯酸酯/十八酸甘油酯/GMSCP100克国产/进口

丁二酸二甲酯/琥珀酸二甲酯/琥珀酸甲酯/Dimethyl succinateCP，98%100毫升国产/进口

乙酰乙酸甲酯/乙酰醋酸甲酯/丁酮酸甲酯/β-丁酮酸甲酯/3-丁酮酸甲酯/MAACP，98%500毫升国产/进口

对羟基苯甲酸甲酯/尼泊金甲酯/4-羟基苯甲酸甲酯/对羟基安息香酸甲酯/泊金M/尼泊金/Methyl 4-hydroxybenzoateCP，98.5%100克国产/进口