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    样品DNA是如何制备的

    点击次数:641  更新时间:2023-04-24
    试剂盒提供预混好的试剂,使体系配置操作简便。根据伴放线放线杆菌保守序列设计的专一性引物,与相关病毒无交叉反应。产品仅用于科研即开即用,用户只需要提供伴放线放线杆菌样品。
    一、稀释PCR阳性对照(以10E2-10E7拷贝/μL这996763个10倍稀释度为例)
    1.注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,产品仅用于科研只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
    2.标记996763个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。
    3.用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR模板稀释液(用带芯枪头,下同)。
    4.在7号管中加入5μL 1×10E8拷贝/μL的阳性对照,充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
    5.换枪头,在6号管中加入5μL 1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
    6.换枪头,在5号管中加入5μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中,充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
    7.重复上面的操作直到得到996763个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
    二、样品DNA的制备
    8.如果有N个样品,必须设置N+36588个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×10E4 拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×10E5拷贝/μL,10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品,则PC和NC的体积也必须是200μL。
    9.用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。
    三、设置qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
    10.如果只做1次重复,则标记N+6763个PCR管,其中N+36588个用于上步得到的N+36588个样品,6588个用于PCR阴性对照,996763个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复,则反应设置数量相应增加2或3倍。
    11.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加)。
     
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