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    胰岛素对细胞增殖影响的实验

    点击次数:1504  更新时间:2015-11-13

    胰岛素对离体犊牛小肠上皮细胞增殖及吸收功能影响的实验

    (一)试验原理

        新生哺乳动物胃肠道的生长发育非常迅速,这与初乳的摄入有关,初乳中含大量多肽类生长因子如胰岛素等。本实验通过体外犊牛小肠上皮培养法,用细胞增殖率和葡萄糖吸收率作为细胞生长发育及功能成熟的指标,探讨胰岛素或其他生长因子对细胞生长发育的影响,同时为新生胃肠道营养发育生理研究提供研究方法。

    (二)材料

    1.待检药物胰岛素(o.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml及50μg/m1)。

    2.动物出生1日龄以内未吮乳的中国荷斯坦犊公牛。

    3.试剂DMEM/F12培养液、DMSO、台盼蓝、15%NCS、葡萄糖。

    4.器材37℃水浴箱、酶标仪。

    (三)实验方法

    1.细胞分离和培养出生1日龄以内未吮乳的中国荷斯坦犊公牛宰杀后放血,无菌条件下取十二指肠约10cm,迅速放人37℃生理盐水中。按照Evans方法制取小肠细胞,用染色法进行细胞计数,存活的细胞活力大于85%时可进行细胞培养。将细胞按1×105/ml接种于24孔培养板上,在37℃、5%CO2孵箱中培养。48h后更换为含不同浓度胰岛素(0.01μg/ml、O.1μg/ml、1μg/ml、lOμg/ml及50μg/ml)的DMEM/F 12培养液,用无血清培养液作为对照。继续培养72 h 后,测定细胞增殖率。

    2.细胞增殖率的测定 各组更换培养液培养。72h后,弃去培养液,每孔加入200μl无血清的DMEM/F12及200μl 0.05%MTT,在5%C02、37℃孵箱中培养4h,弃去培养液和MTT,每孔加入O.5ml DMSO,用酶标仪测定0D540。

    3.葡萄糖吸收率的测定配制葡萄糖浓度为4mg/ml的生理盐水溶液,用其稀释胰岛素,使之浓度分别为O.Olμg/ml、O.1μg/m1、1μg/ml、10μg/ml及50μg/ml。细胞分离后在含15%NCS的DMEM/F12培养液中培养48h,分别用各实验组生理盐水孵育细胞30min,然后按试剂盒要求测葡萄糖吸收量(葡萄糖吸收量=总葡萄糖含量一剩余量)。

    (四)结果与分析

    浓度为O.01μg/ml的胰岛素作用很小,与对照组无显著性差异(P>0.05),无促细胞增殖及促进细胞吸收葡萄糖的作用。随着浓度的增加,胰岛素的促增殖作用及促细胞吸收葡萄糖的作用逐渐增强。但当胰岛素浓度达到50μg/ml的超生理浓度时,胰岛素反而抑制增殖,并抑制细胞吸收葡萄糖。

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