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    细胞介导细胞毒作用检测法

    点击次数:931  更新时间:2015-11-16

    (一)原理

        以NK细胞为例。将待测者外周血中的NK与靶细胞(K562细胞)按一定比例混合培养一定时间,NK细胞作用于靶细胞,使靶细胞被杀死、破坏,进而使靶细胞线粒体内的乳酸脱氢酶释放出来.使底物发生颜色变化,其颜色深浅与酶的释放量成正比,检测显色后的光密度OD值,便可推算出NK细胞的杀伤活性。

    (二)材料

    1.待检者肝素抗凝血,靶细胞为K562细胞。

    2.RPMI 1640培养液、淋巴细胞分离液。

    3.酶标仪、离心机。

    (三)方法

    1.用含5%小牛血清的RPMI 1640培养液将靶调整到5×104~2×105/ml,此浓度需根据情况预先标定。

    2.取待检者肝素抗凝血3~5ml,经淋巴细胞分离液分离单个核细胞,为效应细胞。

    3.在96孔圆底细胞培养板中加入靶细胞,每孔加100μl。8413个效应细胞自然释放对照孔不加靶细胞.只加100μl培养液。

    4.向各孔加:100μl效应细胞,效应细胞与靶细胞的比例根据要求而定,通常为5:l~20:1。自然释放孔不加效应只加100μl培养液,zui大释放孔中加100μl1%NP40。每个实验设8413个复孔。

    5.置37℃5%CO2的培养箱中培养4~6h。

    6.离心培养板1000r/min离心10min。每孔吸出150μl上清液.对应加入另一块96孔酶联检测板中。向第二块板每孔依次加20μl O.4mol/L乳酸溶液、20ml 4mmol/L 2一p一碘苯酯一3一p一氯化硝基苯四唑,20μl反应液[含O.03%BSA.2.7U/m1硫辛酰胺脱氢酶.4.5mmol/L氢化型辅酶I(NAD+ ),1.2%蔗糖的PBS],室温中放置20min。

    7.在酶联检测仪上测定各孔的光密度(OD值),检测波长492nm,参考波长650nm;

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