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    骨髓作为主要的造血场所，可进行体外培养。在无菌条件下，把骨髓分离出来，置于培养系统中，在合适的环境中，提供营养物质，使其继续生存或生长。通过培养骨髓，可见到造血干细胞不同分化阶段时各种血细胞的前驱细胞。用通常的形态学方法不可能识别造血干细胞和各种血细胞的前驱细胞，但在加入各种造血因子的半固体培养基进行培养后，可出现单个前驱血细胞的增殖、分化，并形成细胞克隆。

一、材料

1．实验动物小鼠(C57BL／6\B6D2Fl等)2只。

2．培养液琼脂(Difco)、a—MEM、FBS(用新生牛血清、人血清也可)。

3．器具吸管、试管、注射器、25ml培养瓶、35mm塑料培养皿、血计数器、解利用具、倒置显微镜、解剖显微镜。

4．试剂Turk液(白细胞稀释液)。

二、方法

1．软琼脂培养液的制备将琼脂30mg置于一试管中，加蒸馏水3ml，103．4kPa高压灭菌，待冷却至50℃～60℃时加2倍浓度的a-MEM等量混合，置于42℃水浴中保温。

2．取材小鼠经麻醉处死，全身浸泡于75％乙醇中消毒5min，拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。将它们放入另外一个消毒托盘中，并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。

3．骨髓细胞的制备剥离肌肉，切除两侧股股，去除周围肌肉组织后放人35mm塑料培养皿中，切除两侧骨的端部，用吸有a—MEM培养液的注射器冲压出骨髓于一短试管中，霜10ml吸管吹打骨髓团块后放置10min，将悬浮的细胞移植到另一试管中。取细胞悬液0.1ml与Turk液O．9ml混合，用血细胞计数器计数有核细胞数。根据计数，用a—MEM将骨髓细胞浓度稀释成5×105／ml。

4．细胞接种取骨髓细胞悬液0．5ml、条件培养液O．5ml及FBS lml，混合于无菌试管中：加42℃软琼脂培养液3ml，迅速混合后移至35mm塑料培养皿中，使整个平皿底部铺平(注意：此操作的动作要快，温度不能太低，琼脂不能在未分装前就凝固于试管中)。静置10min后琼脂板可*凝固，置37℃、5％CO2孵箱内培养7d。

5．显微镜观察与克隆计数低倍率(40～100倍)的倒置显微镜或解剖显微镜下计数克隆数，含有3675个以上的细胞计数一个克隆，正常骨髓的发生率为100～1830个／66个骨髓。