技术文章/ARTICLES

    常有刚刚接触ELISA实验的新手说操作复杂，步骤化很多，不易实验。其实当我们掌握了其中的技巧与注意避免之后就会简单很多。：
1. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
2. 所有液体组分使用前充分摇匀。
3. 实验前，产品应保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶*溶解后再使用。
·评价的方法
    1.发质控物进行调查，这是目前国内外常见的形式，采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将结果报至组织者(部、省临检中心)。组织者通过统计分析，再将评价结果寄回实验室，使其了解工作质量，发现问题，提高质量。其缺点为由于各实验室吃小灶或互相打修改结果而达不到真正评价作用。
2.现场调查，事先不通知，临时派出人员到各实验室，规定采用常规方法，检测一组标本，进行评价。这种方法可以解决实际问题，进行现场指导，组织者常因人力、物力的原因而不能经常性进行。

·实验记录
1.所有实验的原始资料均应存档；
2.所有的记录均应规范登记在册；
3.原始登记表应记录试剂来源、批号；
4.质控血清的来源及测定值并注明是否在控；

    抗体 在 ELISA检测试剂盒 中应用的抗体可分为多克隆抗体（多抗）和单克隆抗体（单抗）。多抗取白免疫动物的抗血清，制备较简单，但抗血清成分复杂，除含针对抗原（多个表位）的抗体外，还含有多种其他抗体，亲和力和特异性相对要低于单抗，且制备周期长，批间差异较大。而单抗仅针对抗体的单一表位，亲和力和特异性均较多抗高，且制备技术成熟，产量大，批间差异小，但结合位点的单一也正是其弱点之所在，在双抗体夹心法中，如包被和指示抗体使用同一单抗，则由于结合位点的缺乏，容易造成假阴．性结果。在使用双单抗一步法时，应注意抗原过剩时的“钩状效应"
    2．抗原 在ELISA中应用的抗原要求有较高的特异性、亲和力和纯度。主要有3类，即自然抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。自然抗原的纯度不高，特异性不强；合成抗原一般为多肽片段，缺乏天然抗原所具有的立体结构表位，亲和力不高，可能导致相应表位的抗体漏检；基因重组抗原具有安全、特异性强、亲和力高、产量大等特点，是一种比较理想的抗原，但其纯化比较困难。
    3．包被 将免疫活性物质（抗原或抗体）结合于固相载体上的过程称为包被。常用的材料有聚苯乙烯、硝酸纤维薄膜等；常用的方法有吸附法、化学交联法及亲和素-生物素间接包被法，特别是后一方法，效率高，ELISA检测试剂盒而且可用以包被不易吸附在固相上的各种免疫活性物质。具体做法是先将链霉亲和素包被在固相载体上，然后使与生物素化的抗原或抗体与之结合。由于亲和素与生物素之间的高亲和力，抗原或抗体即间接结合在亲和素包被的固相上.
    4．酶和底物 在 ELISA检测试剂盒 中zui常用的酶为HRP和ALP。
（1）HRP：是一种糖蛋白，含糖量约18％，分子量为44kD，在蔬菜作物辣根中含量很高。HRP是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合形成一种卟啉蛋白质。主酶为五色糖蛋白，在275nm波长处有zui高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，是酶的活性基团，在403nm波长处有zui高吸收峰。HRP的纯度用纯度值（reinhartzahl，RZ）表示，RZ＝A403nm／A275nm，即403nm的吸光度与280nm的吸光度之比，高纯度HRP的RZ值应≥3．0。HRP质量的另一重要指标是酶活力，以单位（unit，U）表示。用于标记的HRP比活性应≥250U／mg。HRP的作用底物为H202，催化下列反应；