微生物在一个较宽的温度范围内生长。但是，要获得高质量的孢子，其zui适温度区间很狭窄。一般来说，提高培养温度，可使菌体代谢活动加快，缩短培养时间，但是，菌体的糖代谢和氮代谢的各种酶类，对温度的敏感性是不同的。因此，培养温度不同，菌的生理状态也不同，如果不是用zui适温度培养的孢子，其能力就会下降。不同的菌株要求的zui适温度不同，需经实践考察确定。例如，龟裂链霉菌斜面zui适温度为36.5～37 ℃，如果高于37 ℃，则孢子成熟早，易老化，接入发酵罐后，就会出现菌丝对糖、氮利用缓慢，氨基氮回升提前，发酵产量降低等现象。培养温度控制低一些，则有利于孢子的形成。龟裂链霉菌斜面先放在36.5 ℃培养3天，再放在28.5 ℃培养1天，所得的孢子数量比在36.5 ℃培养4天所得的孢子数量增加3～7倍。
斜面孢子培养时，培养室的相对湿度对孢子形成的速度、数量和质量有很大影响。空气中相对湿度高时，培养基内的水分蒸发少；相对湿度低时，培养基内的水分蒸发多。例如，在我国北方干燥地区，冬季由于气候干燥，空气相对湿度偏低，斜面培养基内的水分蒸发的快，致使斜面下部含有一定水分，而上部易干瘪，这时孢子长得快，且从斜面下部向上长。夏季时空气相对湿度高，斜面内水分蒸发得慢，这时斜面孢子从上部往下长，下部常因积存冷凝水，致使孢子生长得慢或孢子不能生长。试验表明，在一定条件下培养斜面孢子时，在北方相对湿度控制在40％～45％，而在南方相对湿度控制在35％～42％，所得孢子质量较好。一般来说，真菌对湿度要求偏高，而放线菌对湿度要求偏低。
在培养箱培养时，如果相对湿度偏低，可放入盛水的平皿，提高培养箱内的相对湿度，为了保证新鲜空气的交换，培养箱每天宜开启几次，以利于孢子生长。现代化的培养箱是恒温、恒湿，并可换气，不用人工控制。
zui适培养温度和湿度是相对的，例如相对湿度、培养基组分不同，对微生物的zui适温度会有影响。培养温度、培养基组分不同也会影响到微生物培养的zui适相对湿度。
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