技术文章/ARTICLES

    细胞遗传学毒性检测主要是在分子水平检测毒性物质对遗传性的影响；在遗传性疾病的分子诊断和致病机制研究中，已得到广泛应用。常用的检测技术包括染色体畸变分析、微核试验、基因突变和DNA断裂检测等。

*节染色体标本制备

    染色体是在显微镜下可见的细胞有丝分裂过程中出现的结构。对染色体检查分析之前，需要进行染色体标本制备。通常情况下，都是利用外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。正常情况下．人体外周血淋巴细胞不再分裂，但植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。因此，可采取少量外周静血，做短期培养，刺激增殖后进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞，经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹条带，表明每条染色体的特征。

一、材料与方法

(一)实验材料

1．受试材料人外周血。

2．淋巴细胞分层液 比重为1．077±O．OOl。如Ficoll Hypaque分层液、Percoll—Paque分层液。

3．RPMll640培养液，含20％小牛血清。

4．促细胞分裂剂植物血凝素(PHA)。

5．秋水仙碱(20μg／m1)。

6．75 mmol／LMgCl2。

7．固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)。

8．Macllvaine’s缓冲液(pH 6．0)。

9．奎吖因(QM)染液(50μg／ml)。

10．O.85％生理盐水。

11．0．25％胰酶(pH7．2)。

12．Glemsa染液。

13．O．2mol／LHCl。

14．5％Ba(OH)2 。

15．2×SSc．

16．磷酸缓冲液(pH 7．2)。

(二)实验方法

1．人外周血淋巴细胞培养

(1)根据需要收集全血，加入肝素溶液(O．2ml肝素／10ml全血)抗凝。

(2)用PBS液将抗凝血稀释一倍，轻轻混匀。

(3)将淋巴细胞分层液加于离心管底部，小心操作，尽量避免碰到管壁。

(4)再用毛细管将稀释的血液沿管壁轻轻加到分层液上面，小心操作，不要将血液冲人分层液中。

(5)20OOr／min离心20min。离心后轻轻取出离心管，不要破坏分层(图5—2)。可见从上至下分成6804层：*层为稀释的血浆；第二层为白膜层，主要含淋巴细胞，还混有少量血小板；第三层为分层液；第四层为粒细胞和红细胞层，红细胞沉于管底，粒细胞是紧贴在红细胞层上面的一层薄薄的白膜。

(6)用注射器或吸管沿试管壁吸出中间的白膜层(吸时用钝圆针头或吸管，而不要用尖的头吸)，加入到另外的离心管中。

(7)用5倍以上体积的PBS液洗细胞，1500r／min离心10min，快速吸出上清液。

(8)再用PBS液洗涤2次，zui后一次洗涤后，细胞沉淀重悬于5ml培养液中，细胞计数。

(9)用RPMll640培养液将细胞配成所需密度，转移至培养瓶中加促细胞分裂剂。

(10)终止培养前2～3h，加入浓度为20 μg／ml的秋水仙素，终浓度为O．1μg／ml。轻轻摇匀后，再放入恒温箱内，继续培养2～3h，以积累较多停止在分裂中期的细胞。

2．制片

(1)收获细胞：取出培养瓶，将培养液摇匀后倾入10ml刻度离心管中，1000 r／min离心8～10rnin，吸弃上清液，保留悬液约O．5ml。

(2)低渗处理：向离心管中加入6ml已温浴达37℃75mmol／L的KCl溶液，用吸管混匀，置37℃恒温水浴箱中低渗25～30min(的低渗时间可自行摸索)。

(3)预固定：低渗处理完成后，加入1ml新配制的固定液并用吸管混匀，1000 r／min离心8～10min。吸弃上清液。

(4)固定：加入8ml固定液，用吸管将沉淀的细胞轻轻混合成细胞悬液，室温下静置如min后，1000 r／min离心8～10min。吸弃上清液。

(5)再固定：加入8m1固定液，用吸管轻轻吹打使细胞混匀，室温下静止15min或更长时间。(若不立即制片，可将离心管口盖好，置冰箱中或更长时间)。

(6)制片：将上述细胞混悬液1000 r／min离心8～10min，吸弃上清液，视离心管中沉淀(细胞)的多少加入O．2～O．4ml左右的固定液，用吸管轻轻混成细胞悬液(混合后的液体呈淡乳白色即表示细胞浓度适当)。用吸管吸取细胞悬液尽量高距离地的滴于清洁预冷的玻片上，每片滴1～2滴，静置并在空气中晾干，也可在酒精灯火焰上略加烘烤。

(7)在玻片制成的一周内进行染色体显带。

3．染色体显带一QM荧光染色法

(1)常规制备染色体标本，要求背景清晰无核质覆盖。

(2)浸入pH6．o的Macllvaine’s缓冲液内几秒钟。

(3)标本放入50μg／ml QM溶液中，染色20min

(4)用Macllvalne’s缓冲液(或蒸馏水)冲洗3次，每次2min。

(5)滴数滴缓冲液于标本上，覆盖以大盖玻片。

(6)置荧光显微镜下观察。

4．染色体显带G显带染色法

(1)常规制作染色体标本，置37℃恒温箱内72h。于实验前6h置60℃烘箱中预处理6h。

(2)将O．85％生理盐水50ml置37℃水浴锅内预温至(37±O．5)℃；将O．25％胰酶溶液用O．85％生理盐水稀释，终浓度为O．05％，预温至(37±O．5)℃。

(3)将玻片投入胰酶溶液中不停摆动1 5～17s。

(4)取出玻片，立即用l：10 Giemsa染液(pH7．2磷酸缓冲液配制)染色lO～20min。

(5)自来水轻轻冲洗，空气晾干，镜检。

5．染色体显带c显带染色法

(1)按常规法制备染色体标本，片龄不超过3d。

(2)用O．2 mol／L HCl溶液在室温下处理15～30 min，以除去组蛋白和非组蛋白。

(3)自来水冲洗后，再用蒸馏水冲洗数秒。

(4)将标本浸于预温到55～65℃5％Ba(0H)2水溶液中15～20min。

(5)立即用自来水冲洗．去掉污垢，再用蒸馏水冲洗片刻。

(6)将标本置于预温的55℃2×SS(：溶液中55℃处理l～1．5h。

(7)用蒸馏水冲洗数秒。

(8)用l：10 Giemsa染液染色20～30min。

(9)自来水冲洗，空气干燥，镜检。

二、结果分析

根据染色体的形态、大小及着丝粒的位置，将染色体分为七组。

A组染色体：包括1～3号染色体。长度zui长，1号和3号染色体为中央着丝粒，2号染色体为亚中央着丝粒染色体。

B组染色体：包括4～5号染色体，长度次于A组；亚中央着丝粒染色体，短臂较短。

c组染色体：包括6～12号和x染色体，中等长度，亚中央着丝粒染色体。

D组染色体：包括13～15号染色体，具有近端着丝粒和随体。

E组染色体：包括16～18号染色体，16号染色体着丝粒在3／8处，17号和18号染色体着丝粒约在1／4处。

F组染色体：包括19号和20号染色体，中央着丝粒。

G组染色体：包括21号、22号和Y染色体，是染色体组中zui小的，为近端着丝粒的染色体。21号和22号染色体具有随体。

三、注意事项

(一)接种的血样要新鲜，如不立即培养，应放在4～25℃，于24h内培养。

(二)培养箱温度以(37±O．5℃)为宜。

(三)培养过程中如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻震荡，使凝块散开，然后继续培养。

(四)离心速度过快，团不易打散，速度过低，则使分裂象细胞大量丢失。

(五)玻片要严格清洁，使细胞均匀铺开。